PCR de seqüenciamento
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PCR de seqüenciamento

• Diluir o DNA resultante do PCR de colônia 1:5 em água (60 µl por reação). As amostras previamente analisadas em gel devem ser diluídas com menor volume (48 µl por reação);
• Homogeneizar as amostras;
• Preparar um mix para 100 reações de PCR de seqüenciamento em gelo:

Primer F ou R (15,0 pmoles/µL)	200 µL
ABI BigDye Dye Terminator v.2	200 µL
2,5x dilution buffer	600 µL
H2O milliQ	700 µL
Total	17,0 µL/reação

• Distribuir 17 µL do mix em cada poço de uma microplaca de PCR (ABI MicroAmp Optical 96 well Reaction Plate N801-0560) para seqüenciamento (especial para o ABI 3700);
• Adicionar 3 µL de DNA do PCR de colônia em cada poço (já diluído 1:5), homogeneizando bem com a pipeta  multicanal antes e depois da transferência;
• Centrifugar por 1 pulso a 700 g;
• Tampar a microplaca com selo adesivo ou tampa de borracha;

Proceder ao PCR de seqüenciamento em termociclador ABI 9600 ou ABI 9700 (com rampagem lenta) segundo o programa abaixo:

96°C .....................10 seg. 52°C .....................20 seg.      60°C ..................... 4 min.	40 X
4°C .................. ¥

Remoção dos terminadores

• Adicionar  20 µL de água por poço;
• Adicionar 60 µl de isopropanol 100% por poço;
• Homogeneizar vigorosamente;
• Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente;
• Centrifugar a microplaca a 3.000 g por 30 minutos (ou 1.200 g por 50 minutos) a 20^oC;
• Inverter a microplaca, descartar o sobrenadante e dar um pulso de centrifugação até 700 g com a microplaca invertida sobre papel absorvente;
• Adicionar 150 µL de isopropanol 70% por poço. Não vortexar;
• Centrifugar a microplaca a 3.000 g por 10 min. a 20^oC;
• Inverter a microplaca, descartar o sobrenadante e dar um pulso de centrifugação até 700 g com a microplaca invertida sobre papel absorvente;
• Secar a microplaca por 10 minutos em estufa a 37^oC para a evaporar o isopropanol residual;
• Selar a microplaca com adesivo (ABgene Adhesive Plate Seal #AB-0580);
• Armazenar a microplaca coberta por papel alumínio em freezer –20^oC até o momento do uso.

Apêndice
 
Primer F: CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC – 24-mer
Primer R: TTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC – 24-mer
2,5x dilution buffer: 200 mM Tris-Cl pH 9,0; 5,0 mM MgCl₂.